高品質の開発 | プラスチックベアリング株式会社

Scientific Reports volume 12、記事番号: 22652 (2022) この記事を引用

3090 アクセス

8 オルトメトリック

メトリクスの詳細

生物学研究への 3D プリンティングの応用により、細胞や生物学的材料を複雑な 3D 構造に組織化する方法が組織工学コミュニティに提供されました。商業的なバイオプリンティングプラットフォームは数多く存在しますが、それらは 5,000 ドルから 1,000,000 ドル以上と高価です。この高額な導入コストにより、多くの研究室は 3D バイオプリンティングを研究に組み込むことができません。デスクトッププラスチック 3D プリンタのオープンソースの性質により、代替オプションは、低コストのプラスチックプリンタをバイオプリンタに変換することでした。いくつかのオープンソースの修正が記載されていますが、性能が検証されたコンポーネントを使用して熱可塑性プラスチックプリンタをバイオプリンタに変換するための、ユーザーフレンドリーな段階的なガイドが依然として必要とされています。ここでは、Replistruder 4 シリンジポンプと Duet3D Duet 2 WiFi を使用して、総コスト 900 ドル未満で低コスト 3D プリンター FlashForge Finder をバイオプリンターに変換します。バイオプリンターの移動精度が 3 つの軸すべてで 35 μm より優れていることを実証し、平均誤差 2% 未満で正方格子コラーゲン足場を印刷することで忠実度を定量化します。また、コラーゲンバイオインクを使用して人間の耳の足場を印刷することにより、臨床画像データを忠実に再現することも示します。最後に、アクセシビリティとカスタマイズ性を最大限に高めるために、バイオプリンター変換用に設計したすべてのコンポーネントは、追加のユースケースに合わせてバイオプリンターをさらに変更するための手順とともに、オープンソースの 3D モデルとして提供され、バイオプリンティング分野の包括的なガイドとなります。

積層造形は、複雑な 3D 部品の製造、迅速な設計の反復、低コストのカスタマイズ、およびますます幅広いエンジニアリンググレードの材料の使用を可能にするため、複数の業界に変革をもたらしてきました1。この移行は、新しい 3D プリンティング手法を開発している研究者と、粉体層プリンティング、バット重合、バインダージェッティング、材料押出 (熱可塑性フィラメント押出など) 用の工業規模 3D プリンターを製造している企業によってサポートされています。 3D バイオプリンティングは、これらの技術 2、3、4 の一部を使用して、細胞化された構築物、および潜在的に機能的な組織や器官を構築することで、組織工学分野に同様の改善をもたらす可能性があります 5、6、7、8。 3D バイオプリンティングでは、ポリマー、金属、セラミックの代わりに、印刷されるのはバイオインクです。ここで使用されるバイオインクという用語には、高密度細胞スラリー、合成および天然ヒドロゲル、細胞含有ヒドロゲル、生体材料インク、およびそれらの組み合わせが含まれます。。ただし、3D バイオプリンティングはまだ主に研究開発段階にあるため、広範な採用に対する障壁がイノベーションを制限する役割を果たしています。これらの障壁の中で最も大きな要因は、商用の研究グレードの 3D バイオプリンティングプラットフォームの価格が 5,000 ドルから 1,000,000 ドル以上に及ぶことです。これらの価格帯では、通常、資本設備の購入と専用資金が必要となるため、中核施設や十分な資金を備えた研究室へのアクセスが制限されます。さらに、これらの 3D バイオプリンティングプラットフォームの多くは、追加コストをかけずにカスタムアプリケーション向けに変更することが難しく、新しい生体材料との互換性が限られており、独自のプリンティングソフトウェアとクローズドハードウェアエコシステムを使用しています。

これらの問題の解決策は、2000 年代初頭に始まったオープンソース 3D プリンティングコミュニティで現れ、20099 年の熱溶解積層モデリング (FDM) に関する国内および国際特許の期限切れによって加速しました。初めて、プラスチック 3D プリンティングは、大企業が独占する独自の機器や材料を使用する比較的高価な技術が、新興企業や誰でも使用できる安価な 3D プリンターによって促進されたオープンソース運動に変わってきました。すでに 2012 年には、研究者らは、オープンソースコミュニティによって継続的に改良されてきたこれらの低コストの熱可塑性プリンターを、市販の代替品よりも数万ドル安い費用で高品質の結果を生成できるバイオプリンターに変換し始めました。同様に、コーネル大学の fab@home プロジェクトのような特注 3D バイオプリンターに関する初期の取り組みでは、比較的低コストでオープンソースプラットフォームを構築できる可能性が示されました 10。この期間にわたって、私たちの研究グループは、幅広いオープンソースの熱可塑性プリンター (MakerBot Replicator、LulzBot Mini 2、PrintrBot Simple Metal、FlashForge Creator Pro、MakerGear M2) を高性能 3D バイオプリンターに変換しました 11、12、13。これにより、これらのオープンソースプリンターがすでに備えている高品質の 3 軸モーションシステムを活用できるようになり、特にバイオプリンティングセルや液体バイオインクに必要なシリンジポンプ押出機などのコンポーネントを追加するだけで済みます。さらに、私たちのアプローチでは、熱可塑性プラスチックプリンターの元のフィラメント押出機と同じステッピングモーターを使用して、バイオプリンターのシリンジポンプ押出機を駆動します。これは、プラスチック印刷の場合と同様に、複数の高品質オープンソースソフトウェアパッケージを使用して 3D モデルを G コードにスライスし、印刷プロセスを制御できることを意味します。

私たちが設計した押出機を含む 3D バイオプリンターの修正について説明した出版物はいくつかありますが 12、14、この分野全体として、検証およびテストされたコンポーネントを使用して完全でカスタマイズ可能なオープンソース 3D バイオプリンタープラットフォームを構築するための包括的なガイドが不足しています 15、16、17。 18、19、20。ここでは、広く普及している低コストの熱可塑性 3D プリンタを 1000 ドル以下のバイオプリンタに改造する方法について説明します。 2018 年以来、私たちはカーネギーメロン大学で、世界中から参加するオープンソース 3D バイオプリンティングワークショップを実施してきました。このワークショップでは、参加者が独自のバイオプリンターを構築し、それを Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogel (FRESH) 3D バイオプリンティングに使用する方法を学び、バイオプリンターを持ち帰っています。将来の研究のために母国の機関に送ります。これらの取り組みは、当社のバイオプリンターの設計と修正、およびさまざまなユーザーの背景と経験レベル向けのステップバイステップガイドを検証するのに役立ち、複数の影響力の高い出版物 21、22、23、24、25、26、27 を生み出しました。ここではプリンターとして FlashForge Finder を使用していますが、ここで説明するアプローチは、市場にあるほぼすべての低コストでオープンソースの押し出し 3D プリンターに容易に適用できます。これを行うために、私たちはエレクトロニクスや機械製造に関する最小限の知識を必要とする説明書を作成し、以前に公開されたオープンソースのプリンターコンポーネントと、高品質の印刷構造を生成できるシリンジポンプ押出機を使用しました14。容易な導入と将来のカスタマイズ性を確保するために、Finder の独自のモーションコントロール回路基板を、オープンソースで適応性が高く、使いやすく、非常に十分に文書化された Duet3D のモーションコントロールボードである Duet 2 WiFi に置き換えました。また、このプリンタには、Replistruder 4 オープンソースシリンジポンプも装備されています。このポンプは、私たちの研究室で 10 年近くにわたる設計に基づいて構築されており、複数の公表された研究で使用されています 12、14、21。その結果、市販の代替品と同等以上のパフォーマンスを備え、新しいバイオインクの印刷や高度なアプリケーションの開発に不可欠なハードウェアとソフトウェアの高度なカスタマイズ性を備えた、低コストの 3D バイオプリンターが誕生します。

プラスチック 3D プリンターをバイオプリンターに変換する場合、通常は同じ順序で行われる一連のステップがあります (図 1)。まず、プラスチックプリンターの電子機器と制御システムを改造してバイオプリンティングに適合させるか、代替品と交換する必要があります。独自の FlashForge Finder モーションコントロール回路基板 (図 2A、緑色の長方形) は、オープンソース Duet 2 WiFi モーションコントロール回路基板 (図 2B、青色の長方形) に置き換えられます。これは、モーションコントロールのパフォーマンスを向上させ、WiFi アクセスを提供し、追加のソフトウェアを使用せずに Duet Web ベースのインターフェイスを介してファームウェアの迅速なカスタマイズを容易にするために行われます。このプロセスの段階的な手順は、FlashForge Finder 用にレイアウトされており、ほとんどのデスクトップ 3D プリンターに適用できます (詳細は、補足組み立てガイド、補足図 S1 ～ S15、および提供される Duet2 WiFi 構成ファイルに記載されています)。次に、プリンターに付属の熱可塑性プラスチック押出機を、当社が以前に開発したオープンソースの高性能シリンジポンプ押出機である Replistruder 4 に置き換えます。 Replistruder 4 のほとんどの部品はプラスチックから容易に 3D プリントされ、一般的に入手可能なハードウェアを使用して組み立てられます (図 2C)。キャリッジプラットフォームは、プリンタの既存の直線運動コンポーネントに適合し、Replistruder 4 の取り付けポイントとなるように設計されました。この X 軸キャリッジには、X 軸リニアレールにすでに取り付けられているベアリング用のポケットと、ベアリング用のチャネルがあります。軸に沿った動きを駆動する X 軸ベルトの配線と保持。さらに、凹型 M3 六角ナットを備えた 4 つの取り付けポイントが組み込まれており、Replistruder 4 を X 軸キャリッジに取り付けることができます (図 2D)。 Finder にあらかじめ取り付けられている熱可塑性プリントヘッドは、X 軸キャリッジ/Replistruder 4 アセンブリに置き換えられます (図 2E、F、詳細は補足アセンブリガイド、および補足図 S16 ～ S23)。これらの手順が完了すると、Replistruder 4 (図 2G、青い矢印) が X 軸キャリッジ (図 2G、黄色の矢印) 内のプリンターの X 軸に取り付けられ、モーターが Duet に接続されます。 2 WiFi。バイオプリンターの背面キャビネットに配置されています (図 2H、緑色の矢印)。これらの変更により、FlashForge Finder は、高性能エクストルーダーとモーションコントロールシステムを備えたオープンソースバイオプリンターに変わりました。

プラスチックプリンターをバイオプリンターに変換する手順。プラスチック押出機のプリントヘッドとプラスチックプリンターのモーションコントロールボードは、それぞれシリンジポンプ押出機と Duet2 WiFi コントロールボードに切り替えられます。その後、Duet2 WiFi はバイオプリンターを実行するように構成されます。バイオプリントするには、目的の 3D モデルがマシンパス (Cura Ultimaker ソフトウェアで生成された G コード) にスライスされ、Duet Web Control が目的のバイオインクを使用してプリントを実行します。図の一部は BioRender.com と協力して作成されました。

FlashForge ファインダーをバイオプリンターに変換します。 (A) 元のモーションコントロールボードと配線 (緑色の長方形)。 (B) モーションコントロールボードは Duet 2 WiFi モーションコントロールボード (青い四角形) に置き換えられます。 (C) Replistruder 4 シリンジポンプ押出機が印刷され、組み立てられます。 (D) FlashForge Finder の X 軸キャリッジが 3D プリントされ、Replistruder 4 がそれに取り付けられています。 (E) 取り外される Finder のプラスチック押出機プリントヘッドの上面図。 (F) Replistruder 4 をプリンターに取り付けた後の上面図。 (G) プラスチック押出機のプリントヘッドが、カスタム X 軸キャリッジ (黄色の矢印) に取り付けられた Replistruder 4 シリンジポンプ押出機 (青色の矢印) に置き換えられたことを示す追加の図。 (H) Duet 2 WiFi は、Finder の背面キャビネットに覆われた 3D プリントケースに取り付けられています (緑色の矢印)。

Duet 2 WiFi は、FlashForge Finder やその他の低コストのデスクトップ 3D プリンタに搭載されている純正のモーションコントロール回路基板と比較して、いくつかの重要な利点を提供します。まず、Duet の WiFi ベースの Web インターフェイスにより、プリンターの移動、ファイルの保存と転送、構成設定、ファームウェアの更新にブラウザー内で簡単にアクセスできます。これは、構成設定を編集するプロセスでサードパーティソフトウェアを使用してモーションコントロールボードのファームウェアをフラッシュする必要があるほとんどの 3D プリンタとは対照的です。これは、経験の浅いユーザーにとっては困難で恐ろしい場合があり、偶発的な変更やファームウェアの破損につながる可能性があります。次に、Duet 2 では、(i) 32 ビット電子コントローラー、(ii) 高性能 Trinamic TMC2260 ステッパーコントローラー、(iii) 5 軸の最大 256 × マイクロステッピングによる改良されたモーションコントロール、(iv) など、多くの高度なモーションコントロールの改良が追加されています。 ) より高い電力を生成する 2.8 A の高モーター電流出力、(v) ファームウェアの保存とファイル転送用のオンボード microSD カードリーダー、(vi) 追加の 5 軸、サーボコントローラー、押出機ヒーター、最大 16 の互換性を追加する拡張ボード追加の I/O 接続、および Raspberry Pi シングルボードコンピューターのサポート。最後に、オンライン Duet 2 WiFi のセットアップとサポートに関するドキュメントは徹底的で定期的に更新され、アクティブなユーザーフォーラムによってバックアップされています。この変換のハードウェア面と Duet 2 WiFi の基本セットアップに関するステップバイステップのガイドを提供していますが、追加の変更を加えたい場合は、公式 Duet3D ドキュメントを参照してください。これらの機能を組み合わせることで、高精度のモーションコントロールと、標準のデスクトッププラスチックプリンタを超えた迅速なカスタマイズとパフォーマンスの向上を可能にする使いやすい Web インターフェイスによる広範な拡張性が提供されます。

変換後、3D バイオプリンターの造形体積を決定するために、X、Y、Z 軸の移動限界が測定されました。 X 軸の移動量は 105 mm、Y 軸の移動量は 150 mm、Z 軸の移動量は 50 mm となり、全体の構築体積は 787.5 cm3 になります (図 3A)。この 3D バイオプリンターやほとんどの市販 3D プリンターなど、ステッピングモーター駆動のモーションシステムの場合、パフォーマンスに影響を与える最も重要な制御パラメーターは、3 軸それぞれの mm あたりのステップ数のキャリブレーションです。この数値は、各軸を正確に 1 ミリメートルずつ動かすために、各軸を駆動するステッピングモーターにパルスまたはステップの数を送信する必要があるかを決定します。ベルト駆動の X 軸と Y 軸の場合、式は \(ステップ/mm=(ステップ/回転\×マイクロステップ)/(ベルトピッチ\×プーリーの歯)\) となります。 Finder の場合、これらのパラメータは、駆動ベルトの公称ピッチ (2 mm)、モーターのプーリーの歯数 (17 歯)、モーターの 1 回転のステップ数 (200 ステップ)、およびDuet 2 WiFi が全ステップ間で補間するマイクロステップ (64 マイクロステップに設定)。この場合、X 軸と Y 軸の公称ステップ/mm は 376.5 です。親ネジを使用する Z 軸の場合、式は \(ステップ/mm=(ステップ/回転\×マイクロステップ)/(ネジのピッチ\×ネジの開始位置)\) となります。ファインダーは 4 スタート、2 mm ピッチの親ネジを使用しているため、16 × マイクロステッピングの公称ステップ/mm は 400 ステップ/mm です。

プリンターの移動量の測定と補正。 (A) X 軸の移動量は 105 mm、Y 軸の移動量は 150 mm、Z 軸の移動量は 50 mm です。 (B) 補正前 (赤) と補正後 (青) の 10 mm ウィンドウにわたる X 軸の移動誤差。 (C) 補正前 (赤) と補正後 (青) の 10 mm ウィンドウにわたる Y 軸の移動誤差。 (D) 補正前 (赤) と補正後 (青) の 10 mm ウィンドウにわたる Z 軸の移動誤差。

3D バイオプリンターのパフォーマンスを比較する場合、印刷品質に直接関係する考慮すべき重要な仕様がいくつかあります。ほとんどの熱可塑性 3D プリンタには解像度の仕様があり、これはプリンタが任意の方向に実行できる最小ステップとして定義されます。 FlashForge Finder およびいくつかの一般的な市販バイオプリンターの報告された数値を表 1 に示します。モーションシステムに関連する追加の仕様は、位置誤差です。位置誤差は、プリントヘッドの現在の位置の意図された位置からの絶対偏差として定義されます。再現性は、その位置に複数回到達しようとしたときの平均測定位置からの測定位置の最大絶対偏差として定義されます。これらのより洗練された指標は、バイオプリンティングの分野ではほとんど存在せず、機械コンポーネントや組み立ての精度に基づいて個々のプリンター間で異なる場合があります。さらに、バイオプリンターの仕様で提供される解像度は、一般に、モーションシステムの組み立てに使用されるギア、プーリー、ネジの公称寸法に基づいた理想的な値です。前述のメーカーはいずれも、実際の分解能、つまり全移動距離にわたる誤差、または再現性の測定を提供していません。これらの測定は通常、Aerotech や Physik Instrumente などの超ハイエンドモーションプラットフォームで提供されます28、29。これらの低コスト 3D プリンタベースのシステムの実際のパフォーマンスを判断して最適化するには、外部ツールを使用して移動量を測定する必要があります。

公称ステップ/mm 値が正しいことを検証するために、移動中心付近の各軸に沿ったシステムの位置誤差を 2 μm の精度で定量化しました。 X 軸については、公称ステップ/mm を使用した体系的なアンダートラベルがありました (図 3B、赤い曲線)。移動量 10 mm での最大誤差を使用して、1 mm あたりのミスステップ数を決定し、値を補正しました。この補正されたステップ/mm を使用すると、10 mm ウィンドウにわたる平均移動誤差は 7.9 μm でした (図 3B、青い曲線)。。 Y 軸については、公称ステップ/mm を使用した体系的なアンダートラベルがあり (図 3C、赤い曲線)、補正後、これは 29.1 μm に減少しました (図 3C、青い曲線)。最後に、Z 軸については、公称ステップ/mm を使用して体系的なアンダートラベルがあり (図 3D、赤い曲線)、補正後は 32.3 μm に減少しました (図 3D、青い曲線)。これらの値により、軸の片側のみ (0 ～ 5 mm) から特定の位置に戻る精度である単方向繰返し精度と、特定の位置に戻る精度である双方向繰返し精度の計算も可能になります。軸の両側からの位置 (例: 0 ～ 5 mm、および 10 ～ 5 mm)。 X 軸については、一方向の繰り返し精度は 3.9 μm、双方向の繰り返し精度は 16.4 μm でした。 Y 軸の場合、一方向の繰り返し精度は 11.5 μm、双方向の繰り返し精度は 63.9 μm でした。 Z 軸については、一方向の繰り返し精度は 8.7 μm、双方向の繰り返し精度は 38.7 μm でした。これらの測定を総合すると、キャリブレーションを行った場合、改造したバイオプリンターの移動量の最大誤差は 35 μm、最悪の場合の再現性は 65 μm であることがわかります。キャリブレーション前は位置の誤差が直線的に増加していましたが、キャリブレーション後はこの誤差が大幅に減少しました。このキャリブレーション、または少なくとも誤差の測定がなければ、印刷された構造の欠陥がプリンター自体によるものなのか、印刷品質に影響を与える他の要因によるものなのかを判断することは不可能です。

3D バイオプリンターでは、システムの機械的限界に近い方法でバイオインクを印刷できないため、印刷された構造の忠実度と解像度は通常定量化されません。しかし、FRESH13 などの埋め込みバイオプリンティング技術の最近の進歩により、20 μm に近い解像度で押出バイオプリンティングを実行できるようになりました。したがって、バイオプリンターの印刷性能を実証するために、1000 μm および 500 μm のフィラメント間隔からなる正方格子足場設計を作成し (図 4A)、コラーゲン I 型バイオインクから FRESH を印刷したときの精度を測定しました (図 4B)。グリッド間隔を測定するために、光コヒーレンストモグラフィー (OCT) を使用して 3D 体積画像を取得しました (図 4C)30。これにより、設計通りの寸法と測定された寸法が緊密に一致していることが明らかになりました (図 4D)。これに続いて、成人の耳の 3D スキャンに基づいたより複雑なデザインが続きました (図 4E)。このモデルはコラーゲンを使用して印刷されました (図 4F)。精度を分析するために、OCTを使用して印刷された耳の3D体積画像をキャプチャしました（図4G、補足図S24）30。 3D 再構成はモデルの特徴の再現を示し、3D ゲージ分析により、FRESH プリントされた耳と元の 3D モデルとの間の偏差が -29 ± 107 μm (平均 ± STD) であることが明らかになりました (図 4H)。これら 2 つの例を合わせると、印刷された足場の平均誤差と標準偏差が、私たちが構築したバイオプリンターの機械的制限内にあり、市販のバイオプリンターと同等であることが実証されています 31。

寸法的に正確なグリッドと有機的な形状を印刷します。 (A) 500 μm および 1000 μm グリッドを備えたグリッド足場のモデル。 (B) I 型コラーゲンで印刷されたグリッド足場の写真。(C) グリッド足場プリントの OCT 画像。 (D) グリッド足場プリントの精度の分析 (平均 ± STD。; 1000 μm グリッドの場合は n = 11 測定、500 μm グリッドの場合は n = 26 測定、1000 μm の場合は p < 0.0001 [****]スチューデントの両側対応のない t 検定によると 500 μm)。 (E) 耳の 3D モデル。 (F) I 型コラーゲンで印刷された耳の写真。(G) 印刷された耳の OCT 体積画像。 (H) 元の 3D モデルに対する耳紋の定量的な測定。

ここでは、FlashForge Finder プラスチック 3D プリンターを 3D バイオプリンターに変換し、そのプロセスの詳細な手順を提供しました。いくつかのバイオプリンター変換が出版され、有用な洞察を提供してきました15、16、17、18、19、20が、広く入手可能であり、高いレベルのパフォーマンスを発揮することが検証されています。 FlashForge Finder は低コスト (約 300 ドル) で、オンライン小売業者から世界中で広く入手できるため、研究コミュニティが広くアクセスできるようになります。さらに、十分にサポートされているオープンソースの 3D プリンターモーションコントロール回路基板、Duet3D の Duet 2 WiFi を使用しています。変換に必要なすべてのコンポーネントは、PLA などのプラスチックで 3D プリントされるか、広く入手可能な基本的な締結、直線運動、モーターハードウェアのいずれかです。 Replistruder 4 コンポーネントを含む総コストは 900 ドル未満です。さらに、ステップバイステップガイド (補足資料を参照) では FlashForge Finder の具体的な手順が説明されていますが、その手順は一般化可能であり、他のさまざまな 3D プリンタをバイオプリンタに変換するために使用できます。たとえば、Replistruder を MakerGear M2 や LulzBot Mini 2 などの他のプリンタに取り付けるキャリッジを設計しました (部品ファイルは https://doi.org/10.5281/zenodo.7496012 でダウンロード可能)。これらの要素を組み合わせることで、変換は初心者にとって使いやすい導入となると同時に、より高度な 3D プリンターの変換とカスタマイズの開始点にもなります。

3D バイオプリンティングプロセスに不可欠なのは、プリントされるオブジェクトが入力 3D CAD モデルの寸法および形状と一致していることを確認することです。 Replistruder 4 シリンジポンプ押出機の場合、この検証は以前に公開された研究で実行されています14。ここで構築された 3D バイオプリンターでは、モーション制御パラメーターの公称値により、10 mm の移動範囲にわたって最大誤差が約 100 μm、つまり約 1% 発生しました (図 3B–D)。多くのバイオプリンティングアプリケーションでは、これは十分な精度ですが、プリンターをさらに校正することで、精度が 3 倍の約 33 µm まで改善できることを示します (図 3B ～ D)。ほとんどのバイオプリンターのノズル直径の範囲が 100 ～ 500 µm であることを考慮すると、これにより幅広い用途で高品質の結果が得られます 12、13、30。モーションコントロールシステムの分析は重要ですが、バイオプリンターのパフォーマンスを完全に評価できるわけではありません。性能を完全に評価するために、当社は高性能サブトラクティブ加工に使用されるテストから指針を得ました。このテストでは、機械加工された部品を測定して忠実性を実証します。バイオプリンティングでは、3D バイオプリンティング部品 (つまり、構築物) の測定によって忠実度の同等の評価を実行できます。バイオプリント部品の忠実度は製造中に発生する材料と化学の相互作用にも依存するため、この方法論はプリンターの単なる XYZ 移動解像度よりも関連性が高くなります。私たちが知る限り、現在のバイオプリンターのメーカーは、自社のバイオプリンターで作成された印刷部品 (つまり、構造) の忠実度を測定していないため、オープンソースのバイオプリンターと直接比較することは困難です。

最初のプリント特性評価では、正方格子足場、1000 μm および 500 μm のグリッドが意図した寸法に厳密に一致しており、わずかなずれは、直径 90 μm、長さ 1000 μm のコラーゲンフィラメントのプリント後の取り扱いによるものと考えられます。この推論に沿って、500 μm グリッドの違いは、直交するフィラメント間の接触点がより頻繁にあることだけであり、1000 μm グリッドと比較して精度が向上しました。 2 番目のプリントである耳の足場は、バイオプリンターがより複雑な 3D 形状を生成できることを示し、定量的な計測分析により、コラーゲンバイオインクを使用して達成された忠実度が、他の FRESH 3D バイオプリンターを使用して公開された結果と同様であることが確認されました 13、14、32。経時的な安定性や生体適合性など、FRESH プリントされたコラーゲン構築物の他の重要な特性については、我々の以前の研究で詳しく説明されています 13、30、32。これらの例は、変換された 3D バイオプリンターが、正確な動作と意図した形状の高忠実度の印刷の両方が可能であることを示しています。

オープンソースハードウェアの重要な側面は、その低コストとは別に、特定のアプリケーション向けにその機能を変更および拡張できることです。以前に公開されたReplistruder 4シリンジポンプ押出機については、標準のCADソフトウェアで簡単に変更できる完全な印刷ファイルと設計ファイルを提供しました。ここでは、X 軸キャリッジと、35 mm ペトリ皿やマルチウェルプレートなどのさまざまなサンプルホルダー用の完全な印刷ファイルと設計ファイルを提供することで、これを構築します。これらのファイルを使用すると、さまざまなシリンジのタイプやサイズ、およびさまざまなプリントコンテナに合わせてプリンタを変更できます。 Duet 2 WiFi では、プリントベッド、シリンジのヒーターとチラー、G コードの高度な実装を使用して制御できるセンサーなどの拡張機能も利用できます。複数のシリンジポンプ押出機、レーザー、サブトラクティブツール (ミルなど)、UV 光スイッチング、自動ツールスイッチング、G コードマクロなどの追加ツールもサポートされています。この拡張性と修正の幅広い可能性により、当社の 3D バイオプリンターは、高度な 3D バイオプリンティングアプリケーションを開発するための強力なプラットフォームになります。

最後に、私たちがここで開発した 3D バイオプリンターは、エンジニア、科学者、医師と協力し、これらのシステムを構築して使用するためのトレーニングを行った数年にわたる開発の成果です。これは、当社が 2018 年からカーネギーメロン大学で開催してきた「3D バイオプリンティングオープンソースワークショップ」に基づいており、当社はそこでオーストラリア、カナダ、イスラエル、日本、韓国など世界中の研究機関からの研修生を指導してきました。アメリカ。ここで説明する FlashForge Finder の 3D バイオプリンターへの変換は、2021 年と 2022 年のワークショップで使用され、同梱の段階的な変換ガイドの基礎として機能しました (サポート資料を参照)。私たちは、この出版物を通じて、この取り組みから学び、恩恵を受けることができる研究者の数を増やしたいと考えています。さらに、この 3D バイオプリンターが、オープンサイエンスが研究の進歩の加速に与える影響と、低コストで高性能の科学ツールをできるだけ多くの研究者の手と研究室に置くことの重要性の一例として役立つことを願っています。可能。

プリンタの移動量を高精度で測定するために、プリンタの軸との位置合わせのために Noga 磁気ベースに取り付けられた±2 µm 精度のミツトヨアブソリュートデジマチックインジケータ (ミツトヨ、日本、542-500B) を利用しました。特定の軸を測定するには、ゲージを軸に平行に調整し、最大移動量まで実行してから、Duet Web Control のプリンタ制御を使用して最大移動量より 100 µm 少ない位置まで後退させました (初期移動時のバックラッシュが確実に考慮されるようにするため)上）。次に、Duet Web Control を使用して、軸を公称 1 mm 増分でゲージから遠ざけました。ゲージから取得した実際の位置が記録されました。このプロセスは、公称 10 mm の移動が完了するまで繰り返され、その後、公称位置が再び 0 になるまでプロセスが逆に行われました。ゼロ位置がリセットされ、このプロセスがさらに 2 回繰り返されました。これらの測定値から、誤差は公称位置と測定位置の間の絶対差として定義されました。一方向の再現性は、最初の試行と比較した、各方向の各位置に戻ったときの 2 回目と 3 回目の試行の誤差でした。双方向再現性は、ペアの公称位置での位置の実際の測定値の差の絶対値でした (遠ざかってからゼロに戻ります)。

軸を校正するには、まず各軸の公称ステップ/mm を Duet WiFi 2 構成ファイルに入力します。 3 回の試行から 10 mm の移動での最大誤差が決定され、各軸のステップ/mm が誤差に比例して調整されました。つまり、公称ステップ/mm が 376.5 で、総移動量が 9.887 mm の場合、補正は (10 mm)/(9.887 mm) × (376.5 ステップ/mm) = 380.8 ステップ/mm となります。次に、このプロセスを他の 2 つの軸に対して繰り返しました。校正後、測定プロセスを繰り返して精度を検証できます。

FlashForge Finder 変換および Replistruder 4 のプリントプラスチックコンポーネントのすべての 3D CAD モデルは、Autodesk Inventor 2020 (Autodesk) を使用して生成されました。 Replistruder 4 の CAD ファイルと STL ファイルは、Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.4119127) からダウンロードできます。 FlashForge Finder 3D バイオプリンター変換用の CAD および STL ファイルは、Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7496012) からダウンロードできます。また、MakerGear M2 および Lulzbot Mini 2 を変換するためのファイルもダウンロードできます。 500 および 1000 µm のグリッド間隔は、Autodesk Inventor 2020 を使用して生成されました。耳のモデルは http://www.cgtrader.com/ から購入し、販売者のサクラ pms によって生成されました。

Flashforge Finder 変換および Replistruder 4 の印刷プラスチックコンポーネントの G コードは、PrusaSlicer (Prusa) を使用して生成されました。すべてのモデルは、サポート材なしで 60% 充填の PLA プラスチックから印刷されました。耳モデルの G コードは、Cura 4.3.0 (Ultimaker) を使用して生成されました。グリッドモデルの G コードは、Simplify 3D (Simplify3D) を使用して生成されました。

FRESH v2.0 ゼラチン微粒子支持浴は、公開されている方法 13 に基づいて、ゼラチン微粒子を生成する複雑なコアセルベーション法によって生成されました。簡単に説明すると、2.0% (w/v) ゼラチンタイプ B (Fisher Chemical)、0.25% (w/v) Pluronic® F-127 (Sigma-Aldrich)、および 0.1% (w/v) アラビアゴム (Sigma-Aldrich) でした。１Ｌビーカー中で４５℃の５０％（ｖ／ｖ）エタノール溶液に溶解し、１Ｍ塩酸を加えてｐＨ７．５に調整した。次いで、蒸発を最小限に抑えるためにビーカーをパラフィルムで密封しながら、オーバーヘッドスターラー(IKA、モデルRW20)を使用して混合を維持し、混合物を一晩撹拌しながら室温まで冷却した。得られた溶液を２５０ｍＬの容器に移し、３００ｇで２分間遠心分離してゼラチン微粒子を圧縮した。上清を廃棄し、ゼラチン微粒子を、ｐＨ７．４の５０ｍＭ４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の溶液中に再懸濁した。エタノールとプルロニック® F-127 を除去するために、ゼラチン微粒子支持浴を同じ HEPES 溶液で 3 回洗浄し、使用するまで 4 °C で保管しました。印刷前に、圧縮されていない支持体を 1000g で 3 分間遠心分離し、その後 50 mM HEPES で洗浄しました。最後の洗浄後、ゼラチン微粒子支持浴を 50 mM HEPES に懸濁し、真空チャンバー内で 15 分間脱気し、所望の圧縮レベルに応じて 1900 ～ 2100 g で 5 分間遠心分離しました。最後に、上清を除去し、ゼラチン微粒子支持浴をプリント容器に移した。

すべてコラーゲン I 型バイオインク (LifeInk 200、Advanced Biomatrix)。は前述のように調製されました13。簡単に説明すると、ストックの 35 mg/mL LifeInk をシリンジを使用して 0.24 M 酢酸と 2:1 の比率で混合し、23.33 mg/mL の酸性化コラーゲンバイオインクを生成しました。次に、バイオインクを 3000g で 5 分間遠心分離して気泡を取り除きました。印刷のために、コラーゲンバイオインクを 2.5 mL の気密シリンジ (Hamilton Company) に移しました。

印刷された構造体の写真は、Sony ILCE7M ミラーレスデジタルカメラに取り付けられた Laowa 24 mm プローブレンズ (Venus Optics) を使用して取得されました。 OCT 3D 画像スタックは、OCT-LK4 対物レンズ (Thorlabs)30 を備えた Thorlabs Vega 1300 nm OCT システムを使用して取得されました。 OCT 画像は、フィジー (ImageJ、NIH) を使用して、ノイズ低減、メディアンフィルター処理、およびスタックヒストグラムイコライゼーションを使用して視覚化するために準備されました。次に、画像スタックを TIF ファイルとしてエクスポートし、3D Slicer33 を使用して開きました。次に、ボリュームレンダリング機能を使用して、ボリューム OCT 画像の 3D ビューを作成しました。

測定は以前に説明したように実行されました30。簡単に言うと、耳構造の 3D 体積画像が OCT を使用して取得されました。次に、3D Slicer33 を使用して画像をクリーニングおよびセグメント化し、3D 再構成を生成しました。その後、3D 再構成と元の 3D モデルが CloudCompare (www.cloudcompare.com)34 にインポートされました。 CloudCompare では、2 つの 3D オブジェクトが位置合わせされて登録され、その後、再構成が元の 3D モデルに合わせて測定され、エラーが特定されました。誤差は平均値 ± STD として計算されました。

統計分析およびグラフ分析は、Prism 9 (GraphPad) および Excel (Microsoft) を使用して実行されました。統計的検定は、実験サンプルのサイズ、分布、データ要件に基づいて選択されました。 1000 μm および 500 μm のグリッドプリントの分析は、Fiji (Image J NIH) と MATLAB (Mathworks) を使用して完了しました。 2 つのグリッドサイズの比較には、スチューデントの対応のない両側 t 検定を使用しました。

Replistruder 4 の CAD ファイルと STL ファイルは、Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.4119127) からダウンロードできます。 FlashForge Finder を 3D バイオプリンターに変換するために、CAD および STL ファイルを Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7496012) からダウンロードできます。本文および補足テキストに示されていない生データは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

Attaran, M. 3D プリンティングの台頭: 従来の製造に対する積層造形の利点。バス。ホリズ。 60、677–688 (2017)。

記事 Google Scholar

リー、Ｘら。生体材料のインクジェットバイオプリンティング。化学。改訂 120、10793–10833 (2020)。

記事 Google Scholar

Ng、WLら。バット重合ベースのバイオプリンティング - プロセス、材料、用途、規制上の課題。バイオファブリケーション 12、022001 (2020)。

記事 ADS Google Scholar

Jiang, T.、Munguia-Lopez, JG、Flores-Torres, S.、Kort-Mascort, J. & Kinsella, JM 軟質材料の押出バイオプリンティング: 生物学的モデル作製のための新しい技術。応用物理学。改訂版 6、011310 (2019)。

記事 ADS Google Scholar

Shiwarski、DJ、Hudson、AR、Tashman、JW & Feinberg、AW 高度な組織バイオファブリケーションのプラットフォームとしての FRESH 3D プリンティングの出現。 APLバイオエンジ。 5、010904 (2021)。

記事 Google Scholar

Cui, H.、Nowicki, M.、Fisher, JP、Zhang, LG 臓器再生のための 3D バイオプリンティング。上級ヘルスc. メーター。 6、1601118 (2017)。

記事 Google Scholar

Derakhshanfar、S. et al. 生物医療機器および組織工学のための 3D バイオプリンティング: 最近の傾向と進歩のレビュー。生理活性物質。 3、144–156 (2018)。

記事 Google Scholar

マサチューセッツ州ハインリッヒら。 3D バイオプリンティング: ベンチからトランスレーショナルアプリケーションまで。小 2019、1805510 (2019)。

記事 Google Scholar

Gonzalez, C. インフォグラフィック: 3D プリントの歴史。機械工学: ASME マガジン (2020)。 https://www.asme.org/topics-resources/content/infographic-the-history-of-3d-printing。

Malone, E. & Lipson, H. Fab@Home: 個人用デスクトップファブリケーターキット。ラピッドプロトタイプ。 J. 13、245–255 (2007)。

記事 Google Scholar

ヒントン、TJ 他懸濁ヒドロゲルの自由形状可逆的埋め込みによる複雑な生物学的構造の三次元プリンティング。科学。上級 1、e1500758–e1500758 (2015)。

記事 ADS Google Scholar

Mirdamadi、E.、Tashman、JW、Shiwarski、DJ、Palchesko、RN & Feinberg、AW FRESH 人間の心臓のフルサイズモデルの 3D バイオプリンティング。 ACSバイオメーター。科学。工学 6、6453–6459 (2020)。

記事 Google Scholar

リー、A.ら。人間の心臓のコンポーネントを再構築するためのコラーゲンの 3D バイオプリンティング。サイエンス 365、482–487 (2019)。

記事 ADS Google Scholar

Tashman、JW、Shiwarski、DJ、Feinberg、AW FRESH 3D バイオプリンティング中の押し出しと引き込みに最適化された高性能のオープンソースシリンジ押出機。ハードウェアX。 9、e00170 (2021)。

記事 Google Scholar

イオアニディス、K.ら。カスタムの超低コスト 3D バイオプリンターは、細胞の成長と分化をサポートします。フロント。バイオエンジ。バイオテクノロジー。 8, 580889 (2020)。

記事 Google Scholar

Kahl, M.、Gertig, M.、Hoyer, P.、Friedrich, O. & Gilbert, DF 超低コスト 3D バイオプリンティング: バイオファブリケーション用の既製のデスクトップ 3D プリンターの改良と応用。フロント。バイオエンジ。バイオテクノロジー。 https://doi.org/10.3389/fbioe.2019.00184 (2019)。

記事 Google Scholar

Krige, A.、Haluška, J.、Rova, U.、Christakopoulos, P. プラスチックとゲルの押し出しの切り替えを可能にする、低コストのバイオプリンター改造の設計と実装。ハードウェアX。 9、e00186 (2021)。

記事 Google Scholar

Yetilmez, B.、Temirel, M.、Knowlton, S.、Lepowsky, E. & Tasoglu, S. 低コスト 3D バイオプリンターの開発と特性評価。バイオプリンティング。 13、e00044 (2019)。

記事 Google Scholar

ベスラー、N. et al. Nydus one シリンジ押出機 (NOSE): FRESH メソッドを利用したバイオプリンティングアプリケーション向けの Prusa i3 3D プリンター変換機。ハードウェアX。 6、e00069 (2019)。

記事 Google Scholar

Lei, IM、Sheng, Y.、Lei, CL、Leow, C. & Huang, YYS 軟質材料用のハッキング可能な多機能モジュール式押出 3D プリンター。科学。議員 12、12294 (2022)。

記事 ADS Google Scholar

ハル、SM 他 UNIversal Orthogonal Network (UNION) バイオインクを使用した 3D バイオプリンティング。上級機能。メーター。 31、2007983 (2021)。

記事 Google Scholar

ディン、A.ら。 4次元生細胞バイオプリンティング用の詰まったマイクロフレークヒドロゲル。上級メーター。 34、2109394 (2022)。

記事 Google Scholar

Jeon, O. et al. 複雑な形状を持つ高解像度かつ忠実な人工組織の生成のための、幹細胞を含むハイドロゲルバイオインク。生理活性物質。 15、185–193 (2022)。

記事 Google Scholar

Seymour、AJ、Shin、S.、Heilshorn、SC 細胞浸潤を促進するために調整可能な空隙率を備えたミクロゲル足場の 3D プリンティング。上級ヘルスc. メーター。 10、2100644 (2021)。

記事 Google Scholar

Yang, J.、Tao, JL & Franck, C. 3D プリンティングによるスマートデジタル画像相関パターン。経験値メカ。 61、1181–1191 (2021)。

記事 Google Scholar

ロマナッツォ、S. 他細胞懸濁液中での全方向セラミックバイオプリンティングによる合成骨様構造。上級機能。メーター。 31、2008216 (2021)。

記事 Google Scholar

モリー、TG et al. 光安定化粒状ミクロゲルへの自由形状プリンティングによる異型腫瘍モデル。バイオメーター。科学。 9、4496–4509 (2021)。

記事 Google Scholar

Homan, KA et al. 灌流可能なチップ上の 3D 複雑な腎近位尿細管のバイオプリンティング。科学。議員 6、34845 (2016)。

記事 ADS Google Scholar

Kolesky, DB、Homan, KA、Skylar-Scott, MA & Lewis, JA 厚い血管新生組織の 3 次元バイオプリンティング。手順国立アカド。科学。 USA 113、3179–3184 (2016)。

記事 ADS Google Scholar

タッシュマン、JW 他光コヒーレンストモグラフィーを使用した、FRESH 3D バイオプリント構造の in situ 体積イメージングと分析。バイオファブリケーション 15、014102 (2023)。

記事 ADS Google Scholar

Tong, A. et al. 低コスト 3D バイオプリンターのレビュー: 市場の現状と観察される将来の傾向。 SLASテクノロジー。 26、333–366 (2021)。

記事 Google Scholar

ブライリー、J.ら。ヒト幹細胞由来の心筋細胞を使用した収縮性心臓管の FRESH 3D バイオプリンティング。バイオファブリケーション 14、024106 (2022)。

記事 ADS Google Scholar

Fedorov、A.ら。定量的イメージングネットワーク用の画像コンピューティングプラットフォームとしての 3D スライサー。マグニチュードレゾン。イメージング。 30、1323–1341 (2012)。

記事 Google Scholar

Girardeau-Montaut, D. 3 次元幾何学データの変化検出。テレコム。パリ (2006)。

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補足資料のレビューに協力していただいた Brian Coffin 氏と Andrew Hudson 氏に感謝いたします。また、変換プロセスの実世界でのテストを目的とした、再生生体材料および治療グループの 2021 年および 2022 年の 3D バイオプリンティングオープンソースワークショップの参加者にも感謝したいと思います。さらに、この変換で使用された Duet2 WiFi ケース (thing 3721923) のオリジナルモデルを設計した Thingiverse (www.thingiverse.com) ユーザー ChrisGilleti に感謝します。

この研究は、食品医薬品局 (R01FD006582) および国立衛生研究所の国立心臓、肺、血液研究所 (1F30HL154728、K99HL155777) によって支援されました。

著者 Joshua W. Tashman と Daniel J. Shiwarski も同様に貢献しました。

カーネギーメロン大学生物医工学部、ピッツバーグ、ペンシルバニア州、15213、米国

ジョシュア・W・タッシュマン、ダニエル・J・シワルスキー、アダム・W・ファインバーグ

カーネギーメロン大学材料科学工学部、ピッツバーグ、ペンシルバニア州、15213、米国

アダム・W・ファインバーグ

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著者全員が実験を考案し、科学的な計画と議論に貢献しました。 JWT と DJS は最終的な図とテキストを作成しました。 JWT は変換ガイドを作成しました。 JWT はバイオプリンティングと OCT イメージングを実行しました。 JWT と DJS は、フィジーと MATLAB で画像解析を実行しました。 JWT、DJS、AWF が論文を執筆し、データを解釈しました。

アダム・W・ファインバーグへの通信。

AWFは、FRESH 3Dプリンティングを事業化するスタートアップ企業であるFluidForm Inc.に資本参加しています。 FRESH 3D プリンティングは、米国特許 10,150,258 および暫定特許第 63/082621 号を含む特許保護の対象です。他の著者には利益相反はありません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Tashman, JW、Shiwarski, DJ & Feinberg, AW 高性能オープンソース 3D バイオプリンターの開発。 Sci Rep 12、22652 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-26809-4

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受信日: 2022 年 9 月 11 日

受理日: 2022 年 12 月 20 日

発行日: 2022 年 12 月 31 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26809-4

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