小型製品生産用の球形ロータリーセル播種システム | プラスチックベアリング株式会社

Scientific Reports volume 13、記事番号: 3001 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

完全に生物学的なヒト組織工学血管（TEBV）は、臨床使用のために以前に開発されました。組織工学モデルは、疾患モデリングにおける貴重なツールであることも証明されています。さらに、頭蓋内動脈瘤などの多因子血管病変の研究には、複雑な形状の TEBV が必要です。この記事で報告された研究の主な目標は、完全に人間が分岐した小口径 TEBV を製造することでした。新しい球状回転細胞播種システムの使用により、実行可能な in vitro 組織工学モデルに対する効果的かつ均一な動的細胞播種が可能になります。このレポートでは、ランダムな球面 360° 回転を備えた革新的なシーディングシステムの設計と製造について説明します。カスタムメイドの播種チャンバーがシステム内に配置され、Y 字型のポリエチレンテレフタレートグリコール (PETG) 足場が保持されます。細胞濃度、播種速度、インキュベーション時間などの播種条件は、PETG 足場に接着した細胞の数によって最適化されました。この球状播種法は、動的播種や静的播種などの他のアプローチと比較され、PETG 足場上に均一な細胞分布が明確に示されています。この使いやすい球状システムを使用すると、カスタムメイドの複雑な形状の PETG マンドレルにヒト線維芽細胞を直接播種することによって、完全に生物学的な分岐 TEBV 構築物も生成されます。複雑な形状を持ち、再建された血管全体に沿って細胞分布が最適化された患者由来の小口径 TEBV の作製は、頭蓋内動脈瘤などのさまざまな血管疾患をモデル化する革新的な方法となる可能性があります。

近年の組織工学による血管移植の進歩は、血管疾患の治療や、これらの複雑な疾患を研究するための代替の in vitro モデルの提供に有望な臨床選択肢をもたらしています 1,2。モデルの改良により、血管疾患の背後にある病理生物学をより深く理解するために、定義された遺伝的背景を持つ患者由来の組織工学血管 (TEBV) を作製することが可能になりました 3,4。 TEBV を生成するためのさまざまな技術が長年にわたって開発されてきましたが、それぞれ長所と短所があり、主に 3 つのカテゴリに分類できます：（1）製造された足場上に播種された細胞で作られた血管導管、（2）細胞シートで作られた血管導管エンジニアリングおよび (3) バイオプリンティング 5、6。しかし、血管組織工学における課題の 1 つは依然として、細胞の播種、分布、組織化を改善して細胞を管状構造に均一に組み込むことです。その結果、より単純な静的アプローチよりも動的細胞播種技術が確立されました 7、8、9。さらに、三次元（3D）環境では、均質な組織リモデリングを促進し、細胞密度が高い領域での栄養素の競合を避けるために、細胞分布を均一に監視する必要があります10、11、12、13。動的細胞播種の現状では、ロールボトルを使用し、管状構造物内に内皮細胞を灌流播種することで、線状 TEBV を簡単に作製できます。しかし、これらは、外膜、中膜、および内膜から構成される、より複雑な形状の三層 TEBV の作製には理想的ではありません 4,14,15,16。

これまでに、紫外線 C 線 (UV-C) で前処理したポリエチレンテレフタレートグリコール (PETG) 上に播種した自己組織化直線状小口径血管の生成により、適切な細胞付着と最適化された細胞外マトリックス (ECM) 分泌が保証されることが示されています。組み立て14．複雑な形状の TEBV を製造し、足場に沿った細胞播種を改善するために、効果的かつ均一な細胞分布を可能にするランダムな回転動作を備えた回転システムを開発しました。ここでは、完全な 360° 回転を実行し、完全に生物学的分岐組織工学血管外膜 (TEBV-A) を生成できる革新的な回転播種システムの設計と製造について説明します。

この新しい回転播種システムの構想の初期仕様は、速度調整可能な 360 度回転、少なくとも 24 時間の動作時間、最大 5 台の TEBV の同時生産能力でした。デザインはシンプルでわかりやすく、使いやすいものにしました（図 1A）。このモデルには、支持プレート上の 2 つのモーターによって球状に回転運動する 2 つの半分から作られたアクリル球が含まれており、球の中央に保持された播種チャンバー内で TEBV を生成できます (図 1B–E)。このシードシステムは、360 度ランダムに回転するように適応されています。シード時間中ずっとモーターの一定速度が使用され、球の形状の不完全性により移動軸が変化するため、回転はランダムであると考えられます (補足ビデオ 1)。このシステムは、63 ～ 135°/分の速度調整が可能で、動作時間は 24 時間以上、TEBV の生産能力は 5 台です (図 1F)。播種ステップの間、温度が制御可能な環境に置くこともできます。

ロータリー播種システム。 (A) 方向指示器を備えた CREO 5.0 ソフトウェアを使用したシステムのコンピューター支援設計 (CAD)。 (B、C) 播種チャンバーを所定の位置に保つための 3D プリントされた閉鎖リングとプレートを備えたアクリル球の雄と雌の半分の写真。 (D) 3 つのボールベアリングタイプのサポート、2 つのモーター、および電子制御ユニットを備えたアルミニウム製サポートプレート。 (E) 5 つのカスタムメイドのアクリル細胞播種チャンバー。 (F) 組み立てられた回転式播種システム。スケールバー = 5 cm。

特注の播種チャンバーは、分岐型 PETG 足場上にヒト線維芽細胞を播種するように設計されました (図 2)。チャンバーは、Y 字型の直径 4.8 mm の PETG 足場を収容するのに適した、特注で機械加工された Y 字型のくぼみを備えた 2 つのポリカーボネートの半分で構成されています (図 2A ～ C)。これらの足場はステンレス鋼のピンで固定された 3 つの別々の部品から作られているため、簡単に分解できるようにさまざまな枝を取り外すことができます。下半分にはチャンバーを防水にするための Y 字型の O リングがあり、上半分には細胞と培地を追加できる 3 つの小さな開口部があります (図 2A)。 2 つの半分はステンレス鋼の金具で固定されています。チャンバーに使用されるすべての部品はオートクレーブ滅菌によって滅菌でき、その後、無菌技術を使用して生物学的フードの下でヒト細胞を播種するために使用できます（図 2D）。球体が適切に機能できるように、5 つの密閉播種チャンバーを回転システム内に配置する必要があります (図 2E)。

カスタムメイドの分岐播種チャンバー。 (A) Y 字型のくぼみと Y 字型 O リングを備えた下半分のアクリル播種チャンバーの CREO 5.0 ソフトウェアを使用したシステムの CAD。 (B) ステンレス鋼のダウエルピンを備えたカスタム Y 字型 PETG 足場の CAD。 (C) ハードウェアで閉じられた完全な播種チャンバーの CAD と播種ポート用の小さなネジの図。 (D) 無菌野上の生物学的フード内の播種チャンバーのすべての部品とハードウェアの写真。 (E) ハードウェアで閉じられた完全なチャンバーの写真と播種ポート用の小さなネジの図。スケールバー = 1 cm。

最適な細胞播種パラメーターを決定するために、最初にさまざまな細胞濃度をテストしました。ここでは培地 1 ミリリットルあたりの細胞数 100 万個 (M/mL) で示されている 3 つの初期細胞濃度 (0.1 M/mL、0.15 M/mL、および 0.30 M/mL) を使用してチャンバーに播種しました。細胞を直径4.8 mmのPETGマンドレルに22時間、90°/分の中速で接着させた。次いで、細胞を播種したマンドレルをトリプシンとともに10分間インキュベートし、剥離した細胞を計数した。細胞濃度 0.15 M/mL が最良の細胞播種パラメーターであることがわかりました (0.1 M と比較した 0.15 M/mL、P < 0.0010; 0.3 M/mL と比較した 0.15 M/mL、P = 0.3805) (図 3A) ）。播種後の上清中の細胞数については、条件間で有意な差は観察されませんでした (図 3A)。この最適な細胞濃度を使用して、最適な播種速度、つまり最も重要な数の細胞が足場に接着できる球状回転システムをセットアップする最適な速度を決定したいと考えました。 3 つの異なる播種速度 (63°/分、90°/分、および 135°/分) がテストされました。 PETG 足場に付着した細胞の数は、中程度の 90°/min の播種速度を使用した場合に有意に高いことがわかりました (90°/min と比較した場合は 63°/min、P = 0.0321、135°/min と比較した場合は 90°/min)。 /分;P = 0.0119) (図 3B)。細胞播種後の上清中の細胞数には有意差は観察されませんでした（図３Ｂ）。チャンバー内に細胞を播種した後、異なるインキュベーション時間 (4 時間、8 時間、16 時間、および 22 時間) もテストしました。他の試験したインキュベーション時間よりも多くの細胞が足場に接着したため、ここでは 22 時間のインキュベーション時間が最良のパラメーターであることがわかりました (P < 0.0001)。さらに、播種の 4 時間後には、他の時間と比較して、上清中の細胞数が増加しました (P < 0.0001)。これは、細胞が足場に適切に接着する時間がなく、培養培地中に残っていることを示しています (図 3C) ）。全体として、最適な細胞播種パラメーターは、90°/分の速度で 22 時間、37 °C で 0.15 M/mL の細胞でした。

足場上および上清中に付着した細胞の数は、細胞濃度、播種システムの速度、およびインキュベーション時間に応じて異なります。 (A) 90°/分で 22 時間細胞を播種することにより、培地 1 ミリリットルあたりの細胞数 100 万個の 3 つの細胞濃度 (M/mL) を評価しました。 (B) 0.15 M/mL の細胞を 22 時間播種することで 3 つのシステム速度 (°/分) を評価しました。 (C) 0.15 M/mL を 90°/分で播種することにより、4 つのインキュベーション時間 (時間) を分析しました。統計分析では、Tukey の多重比較検定を使用した二元配置 ANOVA を実行しました。グラフ (A ～ C) はボックスとウィスカーを最大値と最小値とともに表示します。 n = 4 ～ 5/グループ。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。 ns は重要ではありません。

新しい球状シーディング技術を動的および静的シーディング方法と比較しました。まず、播種後の PETG 足場上の細胞分布は、ロダニルブルー染色で観察できます (図 4A)。他の播種技術と比較した場合、球状技術を使用すると、マンドレル上で見かけの均一な細胞分布を観察できます（図4Aおよび補足図1）。さらに、22時間の播種期間後に足場に接着した細胞の適切な数を測定した後、球状播種と他の技術との間に統計的に有意な差は測定されませんでした（図4B）。注目すべきことに、記載された球状システムを使用して生成されたTEBV-Aは、最初の播種後の42日間の培養の成熟期間の後、他の播種技術を使用して生成されたTEBV-Aよりも統計的にティッカーでした（P < 0.05およびP < 0.0001）（図1）。これは、より厚いTEBV-Aの生成には均一な分布が重要である可能性があることを示しています。

さまざまな播種技術によって生産された播種後および成熟した TEBV-A における細胞の分布と生存率。 (A) 播種後の PETG 足場上のロダニルブルー染色細胞の写真。スケールバー = 1 cm。 (B) 22 時間の播種期間後に足場に接着した細胞の数。 (C) 42 日間の成熟期間後に測定された TEBV-A 組織の厚さ (μm)。 (D) 異なる播種技術 (球状、動的および静的) を使用して生成された成熟 TEBV-A から収集された組織切片のヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) 染色。スケールバー = 100 μm。 (E、F) フローサイトメトリーによって分析された、播種後に採取された TEBV-A 細胞の生死アッセイ。 (G、H) 成熟した TEBV-A 採取細胞の生死アッセイ。 (B,C) 最大値と最小値を含むボックスとウィスカー。統計分析のために、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル・ウォリス検定が実行されました。 n = 4 ～ 24。 (F、H) 標準偏差のある積み上げバー。統計分析では、Tukey の多重比較検定を使用した二元配置 ANOVA を実行しました。 n = 5。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、および ****P < 0.0001。 ns は重要ではありません。

ここで考慮し、異なる播種方法を比較するもう 1 つの重要な側面は、細胞の生存率です。したがって、フローサイトメトリーの生死アッセイを使用して、22 時間の播種 (播種後) および 42 日間の成熟期間後の細胞生存率を定量しました。球状播種システムを使用すると、他の播種方法と比較して播種後の生存率が大幅に高くなることがわかりました。動的（P < 0.001）および静的（P < 0.001）（図4E、Fおよび補足図2A）。ただし、テストした播種技術のいずれにおいても、播種後42日間の成熟期間の後、かなり低いものの、細胞生存率の差は測定されませんでした（図4G、Hおよび補足図2B）。成熟した TEBV-A で測定された細胞生存率の低下は、フローサイトメトリー分析のために ECM から細胞を採取するのに 30 分間の酵素消化が必要であることによって簡単に説明できます。この手順は播種後の期間には必要ありません。全体として、開発された球面回転システムを使用すると、他の動的および静的播種技術と比較して、より均一な細胞分布、より厚い TEBV-A、および細胞生存率の向上が測定されました。

ヒト線維芽細胞を用いて作製された完全に生物学的な分岐 TEBV-A は、事前に決定された最適な細胞播種パラメーターを使用して生成されました。細胞播種の 22 時間のインキュベーション期間後、播種チャンバーをシステムから取り外しました。次いで、細胞を播種した足場を培養プレートに置き、培養状態で42日間維持した。レーザーマイクロメーターを使用して各枝の組織の厚さを測定しました（図5A）。 TEBV の 3 つの分岐すべてについて統計的に有意な差は見つかりませんでした。これは、播種されたマンドレル全体に沿って細胞が均一に分布していることを示しています (図 5A、B)。 Y 字型足場などの複雑な形状を備えた TEBV を作製するには、足場全体、特に分岐/接合部位に均一な細胞分布を可能にする細胞播種システムを設計することが非常に重要でした。分岐したTEBV-Aはすべて、肉眼的に重要な接合部位に均一に分布した細胞を示しました（図5C、D）。さらに、組織の厚さは分枝および接合部の組織学的断面から測定されましたが (図 5E、F)、統計的に有意な差は見つかりませんでした (図 5G)。

開発された回転播種システムを使用して生成された分岐 TEBV-A の巨視的および顕微鏡的特性評価。 (A) 分岐型 PETG 足場上の「Y」形状 TEBV-A の写真。 (B) TEBV-A の 3 つの分岐 (I、II、III) の組織厚 (μm)。 N = 4、n = 4; (C) 足場 (D) および足場から切り取られた TEBV-A 接合部の拡大写真。 (E) 足場から切り取られた TEBV-A サンプルの分岐および (F) 接合部の H&E 染色。 (G) TEBV-A の分枝および接合部の組織切片の組織厚 (μm)。 n = 12。矢印は接合部位を示します。統計分析では、ダンの多重比較検定を伴うクラスカル・ウォリス検定をグラフ (B) に対して実行し、グラフ (G) に対してウェルチの t 検定を実行しました。グラフ (B、G) は、バーと標準偏差を含む散布図を示します。スケールバー = 100 μm。 ns は重要ではありません。

この記事では、完全にヒト細胞でできた、複雑な形状を持つ生物学的小口径 TEBV を生成できる回転球状細胞播種システムの設計と構築に成功しました。細胞播種パラメーターは、設計された概念実証の「Y」字型 TEBV の重要な分岐/接合点でも、足場領域全体に沿って細胞の分布と接着を改善するために最適化されました。他の動的および静的播種アプローチと比較して、当社の新しい球状播種方法では、生成された TEBV 全体に沿って細胞がより均一に分布し、播種後の細胞生存率が高く、より厚い組織が生成されます。記載されているシステムには、播種チャンバー内に収まるように設計された UV-C 処理された PETG 足場を含む、特注で機械加工され、簡単に滅菌できる播種チャンバーが含まれていました。注目すべきことに、播種チャンバーは他の形状/仕様で簡単に再設計でき、異なる血管の形状、サイズ、分岐点の角度に合わせて調整できます。

チャンバーへの最初の播種時の細胞濃度 0.15 M/mL と、90°/分の速度で 22 時間全方向 (x、y、z) へのランダム回転を組み合わせることが、最適な播種パラメータであることが判明しました。 PETG足場に沿った細胞の接着と分布を促進します。播種チャンバー内での 22 時間のインキュベーション期間後、細胞を播種した足場をチャンバーから取り出し、培地中で 42 日間培養して、ECM の産生、組み立て、TEBV の成熟を促進しました。細胞と固体足場の間の相互作用の動態はラングミュアモデルに従い、その 3 つの仮定が細胞培養に適用されました。(i) 細胞は付着して単層以上を形成することができません。 (ii) 細胞は足場のすべての表面に付着できます。 (iii) 細胞は、単層に達するまで、既に付着している細胞とは独立して足場に付着することができます 17,18。 PETG の UV-C 処理は、プラスチックのカルボニル基を修飾することで細胞接着を促進し、その結果、材料の親水性が増強されることが知られています 14、19、20、21。ラングミュア理論によれば、記載された動的播種システムの回転運動は、処理されたプラスチックマンドレルの表面全体で細胞と足場の相互作用を促進し、より良好な細胞接着と分布を可能にします7、8、22。実際、この新規システムの 360° ランダムな動きにより、細胞は播種期間中に複雑な幾何学的足場のすべての部分に遭遇することができました。これは、「Y」字型 TEBV の枝に沿って測定された均一な組織の厚さによって示されました。ラングミュアの 3 番目の仮定は、単層に到達すると、細胞は独立して足場に付着するのをやめ、他の付着細胞と相互作用し始めることを意味します。この細胞間相互作用の時間の経過による増加は、細胞が足場から剥離することを促進し、細胞密度が高いPETGから同量またはより少ない細胞が回収され、実質的にプラトーに達した理由を説明している可能性があります17,21。

システムの中央速度は、90°/min での細胞播種に最適であると考えられました。テストされたすべての速度は比較的低速でしたが、システムは播種中ずっと細胞を培地に浮遊させておくのに十分な速度である必要がありますが、細胞が適切に相互作用してプラスチックに付着するのに十分な速度である必要がありました。細胞付着を増加させるには、22 時間という長い播種期間も必要でした。他のモデルでは、長時間低速で細胞接着を促進することも示されています 23,24。速度、細胞密度、時間などの細胞播種パラメータは、細胞の種類（細胞と足場の相互作用、細胞接着、マトリックス生産能力）に依存するため、各組織工学モデルおよび播種する細胞の種類に合わせて最適化する必要があります9 、25、26、27、28。流体力学のストークスの法則を使用して、テストした線維芽細胞集団の播種チャンバー内の沈降速度 (V) を 2.5 μm/s と推定しました。 V = (g(ρp − ρf)d2)/18μ は、次の定数を使用して計算されます。重力 (g: 9.81 m/s2)、細胞密度 (ρp: 1050 kg/m3)、ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) 密度 (ρf: 1007 kg/m3)、線維芽細胞の細胞直径 (d: 10 μm)、DMEM 粘度(μ: 0.00093 Pa s)29,30. 遅いとはいえ、この線維芽細胞の沈降速度と 22 時間の球体のランダムな回転運動の組み合わせにより、形状の複雑さにも関わらず、回転播種チャンバー内の足場上で均一な細胞分布が可能になります 30。、31。

球体を低速で 360° ランダムに回転させるためにブラシモーターを使用すると、その能力の最大値に達するため、いくつかの制限が生じます。サーボモーターにアップグレードすると、過熱、抵抗の増加、電圧の低下によってモーターが勝手に停止するリスクを排除しながら、より正確な回転が可能になります。この回転セル播種システムは、ポテンショメータを使用してモーターへの電圧を調整し、回転速度を決定します。マイクロコントローラーシステムと電子ディスプレイを追加すると、細胞播種中の電圧調整が改善され、回転速度がより正確になる可能性があります。

他の播種技術と比較して、開発された球状播種システム法では、播種期間中に最初に足場に接着した細胞の数に関係なく、42 日間の細胞培養後により厚い成熟 TEBV-A を生成するだけでなく、PETG 足場上に細胞を均一に分布させることができました。。より均一な細胞分布は組織の成熟を助け、その結果 ECM の分泌と集合を改善する可能性があります 32,33,34。複雑なヒトの病態に関連する細胞、組織組成、および微小環境間のクロストークをより適切に表現するには、組織工学における細胞間相互作用および細胞とECMの相互作用が疾患モデリングに必要であることが示されています11、35、36。

外膜 (線維芽細胞)、中膜 (平滑筋細胞)、および内膜 (内皮細胞) を組み込んだ完全な TEBV モデルですが、分岐 TEBV モデルの現在の状態は、分岐血管プロテーゼからクリニックの分岐血管ステント、分岐コラーゲンチューブへと急速に進化しています。内皮細胞や 3D プリントされた分枝血管移植片への応用も可能です 4,37,38,39。私たちの知る限り、私たちは外因性物質を含まない外膜の全生物学的小口径分岐TEBVモデルを作製した最初の研究チームです。特に興味深いのは、重要な接合部位が無傷のままであり、足場を分解した後も剥がれなかったことです。この革新的なシステムにより、まだ灌流はできませんが、たった 1 枚の単層線維芽細胞シートで操作、観察、研究が可能な十分な厚さの組織の作製が可能になります。複数の連続細胞播種は、より厚い多層 TEBV を作製するための次の適切なステップとなる可能性があります 40。

複雑な形状をもつ患者由来の小口径 TEBV の作製は、さまざまな血管疾患をモデル化する革新的な方法となる可能性があります。たとえば、構築された Y 字型 TEBV は、主に罹患者のウィリス輪分岐部で発生する頭蓋内動脈瘤 (IA) を研究するためのユニークな in vitro モデルとなるでしょう 41,42。 IA は、脳血管壁の脆弱化により局所的なバルーニングが生じる脳血管障害です 43。 IA は、破裂後の死亡率が 50%、生存者の罹患率が 30 ～ 50% になります 44。人工的だが生理的な血流を生成できるバイオリアクターで培養された Y 字型 TEBV の使用は、IA と血行動態の研究において特に興味深いものとなるでしょう。 IAの遺伝的構成要素はまだ十分に理解されていないため、内膜、中膜、外膜を備えた完全に再構成された血管を生成する患者由来の多層分岐TEBVも、病原性および病態生理学的なIA関連メカニズムの研究にとって非常に興味深いものとなるだろう。

結論として、我々は、使いやすく、洗浄可能で滅菌可能で、複雑な形状を有する外膜の 5 つの小口径管状 TEBV を生成できる革新的な回転細胞播種システムを紹介しました。全体として、播種システムとチャンバーは概念化されており、操作が簡単になるようにカスタムメイドされています。したがって、細胞播種中に細胞を足場全体に均一に分散させることが 3D 培養および組織工学にとって重要であることを考慮すると、記載されたシステムは将来の研究に多大な影響を与えるでしょう。

CREO 5.0 ソフトウェア (PTC、米国マサチューセッツ州ボストン) を使用して、建設前にシーディングシステムの CAD を作成しました (図 1A)。この球体は、直径 10 インチのアクリル製中空球体 (California Quality Plastics、オンタリオ、カリフォルニア州、米国) の 2 つの半分から作られました (図 1B、C)。 3D プリントされた 2 つの閉鎖リングは PETG 1.75 mm フィラメント (Filaments.ca、オンタリオ州ミシサガ、カナダ) で作られ、H800 3D プリンター (米国ミネソタ州チャンハッセンの Afinia) でプリントされ、医療用 Silastic™ で球の半分に接着されました。グレードのエラストマー (Dupont、ウィルミントン、ノースカロライナ州、米国)。閉鎖リングは、雄型 PETG リングにねじ込まれ、雌型 PETG リングにロックされたステンレス鋼のボタン頭六角ねじ (McMaster-Carr、米国イリノイ州シカゴ) によって一緒に維持されます。 3D プリントされたプレートは、播種チャンバーを所定の位置に保持するために前述のように概念化され、プリントされました。プレートは、Silastic™ で球の半分の中心に接着された 3D プリントされたサポートで球に取り付けられました。システムの回転中に播種チャンバーが所定の位置に留まるように、ステンレス鋼の耐食性スプリング (McMaster-Carr) を介して圧力を加えました。サポートプレートは、3軸フライス盤（米国ニューヨーク州パターソンのフライヤーマシンシステムズ）を使用して、6061-T6アルミニウム合金（カナダ、ケベック州リーバイスのAcier Picard）から作成されました（図1d）。 2 つの DC ブラシモーター 12 V、10 RPM (RobotShop、ミラベル、ケベック州、カナダ) を互いに垂直に配置し、システムに回転運動を提供しました。 2 つのモーターブラケットと 3 つのアルミニウム製ボールベアリングタイプのサポートがカスタムメイドされ、プレートに取り付けられました。耐食性のステンレス鋼のボールがサポートベアリングの内側に配置され、球の適切な回転を確保し、追加のサポートを提供しました (McMaster-Carr)。電流を供給し、速度を制御する電子部品は、3D プリントされた PETG ボックス内に配置されました。モーターは、別個の 3 ポジションスイッチ、25 k ポテンショメータ、リニア電圧レギュレータ (Digi-Key、米国ミネソタ州シーフリバーフォールズ)、および医療グレードの AC/DC 5 V 電源 (カナダ、オンタリオ州ミシサガ、ニューアーク) に接続されました。 ) 通常の 125 V 壁コンセントに差し込みます。すべての写真とビデオは、iPhone 12 mini カメラ (Apple、米国カリフォルニア州クパチーノ) で撮影されました。

CREO 5.0 ソフトウェア (PTC) は、播種チャンバーの CAD の作成にも使用されました (図 2A ～ C)。チャンバーは、2 つの異なるカスタムメイドのポリカーボネートの半分で構成されていました (Groupe PolyAlto、ケベック州、ケベック州、カリフォルニア州)。３軸フライス盤（フライヤーマシンシステムズ）を使用して、Ｙ字形のくぼみを両方の半分に切断した。下半分は、播種チャンバーの半分を互いにシールするために、Y 字型の高温ソフトシリコン O リング、分数幅 3/32 (McMaster-Carr) で囲まれました (図 2D)。上半分は、播種ポートとして機能する 3 つの開口部で作られ、高温ソフトシリコン O リング、分数幅 3/64、および 18-8 ステンレス鋼の円錐先止めネジ、M4 × 0.7 mm ネジ、4 で密閉されました。長さ mm (McMaster-Carr)。 Y 字型の分解可能な足場は、直径 4.8 mm の PETG ロッド (McMaster-Carr) から 5 軸フライス盤 (米国ニューヨーク州パターソンのフライヤーマシンシステムズ) でカスタムカットされ、18-8 ステンレス鋼ダボで固定されました。ピン、直径 1/32 インチ、長さ 1/4 インチ (McMaster-Carr)。これらの足場は、播種チャンバーの中央の Y 字型のくぼみの内側に配置され、2 つの半分が結合され、316 ステンレス鋼のボタン頭六角ねじ、M4 × 0.7 mm ネジ、長さ 16 mm を使用して完全に閉じられます。 M4 ネジ用の汎用 316 ステンレス鋼ワッシャーサイズ、内径 4.300 mm、外径 8 mm、および 316 ステンレス鋼六角ナット、超耐食性、M4 × 0.7 mm ネジ (McMaster-Carr) (図 2E)。すべての写真は iPhone 12 mini カメラ (Apple) で撮影されました。

ヒト皮膚線維芽細胞は前述のように単離され 45、10% ウシ胎児血清 (FBS; VWR、ラドナー、ペンシルベニア州、米国)、100 IU/mL ペニシリン G および 25 μg/mL を含む DMEM (Invitrogen、オンタリオ州バーリントン、カナダ) で培養しました。ゲンタマイシン（Sigma-Aldrich、川崎、OL、日本）。ヒト細胞の使用は、CHU de Quebec の倫理研究委員会によって承認され (プロトコル番号: 1115C および 1115D)、個人はインフォームドコンセントに従って自発的に採用されました。細胞を、直径４．８ｍｍのＵＶ－Ｃ処理ＰＥＴＧロッド（ＭｃＭａｓｔｅｒ－Ｃａｒｒ）を含むチャンバーに１０ｍＬのＤＭＥＭ培地とともに播種した。播種チャンバーは回転播種システムに配置され、下流の実験のために 37 °C に保たれました。 UV-C 処理は前述のように 30 分間/片側 (90° 回転) 実行し、その後 0.2% ゼラチン (Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) でコーティングしました 14。最初の播種中に使用する最適な細胞濃度を決定するために、3 つの条件 (0.10、0.15、および 0.30 M/mL) をテストし、細胞チャンバーに添加し、中速の回転システムに 22 時間置きました。細胞播種パラメータをより最適化するために、3 つの異なる回転速度もテストされました。チャンバーに線維芽細胞 (0.15 M/mL) を播種し、63°、90°、または 135°/分の回転速度で 22 時間回転球内に設置しました。これらの速度は、到達可能な最小速度、中央値、および最大速度とみなされました。球体によって。細胞播種後の異なるインキュベーション期間もテストしました。播種チャンバーに線維芽細胞 (0.15 M/mL) を播種し、球内に 90°/分の回転速度で 4、8、16、および 22 時間配置しました。

上清を回収し、これらの各インキュベーション時間の終了時に300×gで10分間遠心分離した。上清中に存在する未結合の遠心分離された残りの細胞を 1 mL の DMEM 培地に再懸濁し、セルカウンター (Beckman Coulter、米国カリフォルニア州パサデナ) を使用して計数しました。細胞を播種したPETGロッドまたはY字型足場を最初にトリプシン0.05％（Fisher Scientific）/EDTA 0.01％（Teknisciences、テレボン、QC、カナダ）とともに10分間インキュベートして細胞を剥離し、その後300×gで遠心分離しました。 10分間回収した細胞を１ｍＬの培地に再懸濁し、次いでコールター細胞計数器（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）によって計数した。

ヒト皮膚線維芽細胞は、10% FBS および抗生物質カクテルを含む DMEM 培地で培養されました。 0.15 M/mL の細胞を、播種穴を介して特注の播種チャンバーに播種しました。合計 10 mL の DMEM 培地を、直径 4.8 mm の PETG ロッド (McMaster-Carr) で作られた Y 字型足場を含む播種チャンバーに注入しました。 PETG 足場は、前述のように UV-C で前処理され、次に 0.2% ゼラチン (Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) でコーティングされました 14。球状播種の場合、播種したチャンバーを 37 °C の部屋で 90°/分で 22 時間球内に配置しました。動的播種の場合、播種したチャンバーをオービタルシェーカー (BlotBoy、Benchmark Scientific、Sayreville、ニュージャージー州、米国) 上に 37 °C、8% CO2 インキュベーター内で 22 時間配置しました。静的播種の場合、チャンバーを 37 °C、8% CO2 インキュベーター内に直接 22 時間の播種期間置きました。次に、細胞を播種した足場を回収し、50 μg/mL アスコルビン酸 (Sigma) を補充した DMEM 培地を含む 500 cm2 細胞培養プレートに、37 °C、8% CO2 インキュベーター内で 42 日間置きました。培地は 2 ～ 3 日ごとに交換し、培地交換のたびに足場を 180°回転させました。

細胞を播種した Y 字型 PETG 足場の肉眼画像を iPhone 12 mini カメラ (Apple) で撮影しました。 Y 字型足場の 3 つの異なる枝上の組織の厚さを、高精度レーザーマイクロメーター (カナダ、オンタリオ州ミシサガの Keyence) で測定しました。統計分析には、4 つの異なる Y 字型 TEBV の各ブランチに関する 4 つの異なる測定値が使用されました。 TEBV を 3.7% ホルマリン中で一晩固定しました (ChapTec、モントリオール、ケベック州、カナダ)。組織学的分析の前に、生検された TEBV 結合部位の肉眼写真も撮影されました。次に、固定された 10 μm TEBV 断面を、前述のようにヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) で染色しました 36。顕微鏡画像は、正立顕微鏡（AxioImager.M2; Carl Zeiss Microscopy、Jena、TH、ドイツ）を使用して明視野条件下で取得および測定されました。分布分析のため、播種した足場を 3.7% ホルマリンで 30 分間固定し、その後ロダニルブルー染色液に 15 分間置き、すすぎ、乾燥させてから足場のすべての側面の肉眼写真を撮りました。

22時間の播種期間後、上清を回収し、各播種技術ごとに300×gで10分間遠心分離した。細胞を播種したPETGロッドをトリプシン0.05％（Fisher Scientific）/EDTA 0.01％（Teknisciences）とともに10分間インキュベートして細胞を剥離し、その後300×gで10分間遠心分離した。上清および足場から回収した細胞を、生細胞を標識するために Calcein AM 2.5 nM (Thermo-Fisher) とともに、死細胞を標識するために Ethidium homodimer-1 4 μM (Thermo-Fisher) とともに 15 分間インキュベートしました。細胞は直ちに BD FACSMelody™ フローサイトメーター (BD Biosciences) で分析され、データは FlowJo™ v9 ソフトウェア (Ashland, OR, USA) を使用して処理されました。成熟組織の場合、まず足場から組織を回収し、アキュターゼ (Sigma-Aldrich) 中の 5.7U/ml コラゲナーゼ H (Sigma-Aldrich) の消化溶液に、37 °C で 300 rpm で 30 分間撹拌しながら配置しました。細胞を４０μｍセルストレーナー（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通して濾過し、３００×ｇで１０分間遠心分離した。最後に、以下に説明するように細胞を分析しました。

統計分析は、GraphPad Prism 9.0 ソフトウェア (GraphPad、米国カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して実行されました。最大値と最小値を含む箱ひげグラフで示されたデータは、Tukey の多重比較検定を使用した二元配置分散分析、または Dunn の多重比較検定を使用した Kruskal-Wallis 検定によって分析されました。平均および標準偏差 (SD) を含む散布図で示されたデータは、ダンの多重比較検定を使用したクラスカル・ウォリス検定またはウェルチの t 検定によって分析されました。 SD を含む積み上げバーで示されたデータは、ダンの多重比較検定を使用したクラスカル・ウォリス検定によって分析されました。 < 0.05 の P 値は統計的に有意であるとみなされました。

この研究は、私たちの施設内倫理委員会 (ケベック州立大学の倫理研究委員会、プロトコル番号 1115 C および 1115 D) によって承認されました。詳細については、([email protected]) までお問い合わせください。すべての実験は以下に従って実施されました。国家三評議会政策ガイドライン: 人間が関与する研究の倫理的行動に準拠しており、ケベック州ラヴァル大学の倫理委員会によって承認されています。

研究に自発的に参加したすべての被験者からインフォームドコンセントを得た。

この研究で提示されたデータは、責任著者からの要求に応じて入手できます。

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リファレンスをダウンロードする

ラヴァル大学機械工学ワークショップの Marc-André Campagna、André Chamberland、Patrick Dupuis、Frédéric Moerin、Pierre Carrier に感謝します。技術的な支援と貴重なアドバイスをいただいた Todd Galbraith、Vincent Clement、Isabella Bienjonetti、Richard Brodeur に感謝いたします。

この研究は、New Frontiers in Research Fund (NFRF) および Canadian Institutes of Health Research (CIHR) からの助成金によって支援されました。 JR は NFRF の受信者です。 FG-L。カナダ研究委員会の受賞者です。 VR は、ケベックアンサンテ財団 (FRQS) から博士課程の奨学金を受けています。

カナダ、ケベックシティ、ラヴァル大学医学部外科

アリッサ・ブロドゥール、ヴァンサン・ロイ、リディア・トゥーゼル・デシェーヌ、フランソワ・グロ＝ルイ

カナダ、ケベックシティ、ラヴァル大学、CHU de Quebec Research Center、再生医療部門

アリッサ・ブロデュール、ヴァンサン・ロイ、リディア・トゥゼル・デシェーヌ、フランソワ・グロ＝ルイ、ジャン・リュエル

カナダ、ケベックシティ、ラヴァル大学理工学部機械工学科

アレクサンドル・ウィンター & ジャン・リュエル

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概念化、AB、AW、VR、FG-L.、JR。方法論、AB、AW、VR、LT-D.、FG-L。そしてJR。ソフトウェア、ABおよびAW。検証、VR、FG-L。そしてJR。形式分析、AB および VR。調査、AB、AW、LT-D。リソース、LT-D.、FG-L. そしてJR。データキュレーション、ABおよびAW。執筆—原案作成、AB。執筆 - レビューと編集、AB、AW、VR、FG-L。そしてJR。ビジュアライゼーション、AB、VR。監修、VR、FG-L。そしてJR。プロジェクト管理、FG-L。そしてJR。資金調達、FG-L。および JR すべての著者は原稿の出版版を読み、同意しました。

ジャン・リュエルへの手紙。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Brodeur, A.、Winter, A.、Roy, V. 他複雑な形状の小口径組織工学血管を作製するための球状回転セル播種システム。 Sci Rep 13、3001 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-29825-0

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受信日: 2022 年 9 月 8 日

受理日: 2023 年 2 月 10 日

公開日: 2023 年 2 月 21 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29825-0

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